【ELISA攻略】ELISA關(guān)鍵一步!這10類(lèi)樣品要如何處理?

       Elisa是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確可靠的定性定量分析方法。樣本的處理對(duì)于Elisa 實(shí)驗(yàn)的成功起著關(guān)鍵的作用。處理樣本的過(guò)程就是收集目標(biāo)蛋白的過(guò)程，由于蛋白容易變性，降解，故該過(guò)程應(yīng)盡量溫和。樣本處理之后的儲(chǔ)存也非常重要，尤其注意不要反復(fù)凍融。

樣本處理之后可分裝密封保存，最佳保存條件:2-8C保存應(yīng)小于5天，-20°不應(yīng)超過(guò)6個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過(guò)2年，超過(guò)以上時(shí)間應(yīng)保存在液氮中。凍存的標(biāo)本融化時(shí)，為了減少冰晶(0度)對(duì)樣品的破壞，應(yīng)采用15-25°C水浴快速融化，融化后可用于檢測(cè)或暫存于2-8°℃。正確處理樣本的方法是保證ELISA檢測(cè)準(zhǔn)確性的第一步。

利用ELISA進(jìn)行檢測(cè)的樣本類(lèi)型包括:血液(血清、血漿)、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等。

常見(jiàn)的樣本處理 方法如下，僅供參:

血液樣本

1.血清:

①將收集于血清分離管的全血樣本，在室溫放置2小時(shí)或2-8°C過(guò)夜。(這是一個(gè)讓血液自然凝固的過(guò)程，溫度越低，

凝集越緩慢，可根據(jù)需要添加促凝劑。)

②1000xg離心 20 分鐘，取上清。

③可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20°C或-80'℃。

2.血漿(檸檬酸，EDTA,肝素):

①血漿樣本需要抗凝，將全血收集到干凈的含抗凝劑的試管中，輕輕混勻。

②標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8°℃ 1000xg離心15分鐘，取上清。

③可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20°C或-80°℃。

血清/血漿的區(qū)別與選擇

血清是血液凝固后缺少纖維蛋白原的血漿，故血漿中除含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均等同于血清。由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血產(chǎn)物。如果檢測(cè)凝血因子，建議選擇血漿樣本;

因血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對(duì)待檢測(cè)指標(biāo)有影響，建議選擇血清樣本;大多數(shù)情況下二者均可以選擇。

組織樣本

組織樣本一般制成組織勻漿，處理方法如下:

①使用干凈的工具解剖目標(biāo)組織，盡快置于冰上，以防被蛋白酶降解。(暫時(shí)不處理的組織，置于圓底微量離心管中，浸入液氮中“速凍”，在 -80'℃下存儲(chǔ)樣品備用)

②用預(yù)冷的PBS緩沖液(0.01M，pH=7.4)洗滌組織去除殘留的血液，稱(chēng)重后備用。若組織塊較大，需先剪碎。

③在冰上用研磨緩沖液(常用PBS緩沖液，但最好使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3?；蛘咧械葟?qiáng)度RIPA 細(xì)胞裂解液，注意 RIPA 裂解液 PH 值需為PH7.3，建議不要使用含NP-40，TritonX-100和高濃度DTT的組分，會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)。)

研磨組織勻漿(加入研磨緩沖液的體積取決于組織的重量。一般情況下，每1克組織碎片應(yīng)使用9ml研磨緩沖液。另外建議在研磨緩沖液中加入一些蛋白酶抑制劑，如1mMPMSF)。得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理(超聲破碎過(guò)程中，需冰浴降溫;反復(fù)凍融法可重復(fù)2次)。

④將制備好的勻漿液于 5000xg離心5分鐘，留取上清即可檢測(cè)?；蚍盅b凍存于-20°C或-80'℃。

⑤根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，組織勻漿樣本可先定量總蛋白,以便于統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，一般調(diào)整總蛋白濃度至 1-3mg/ml。某些組織樣本，如肝臟，腎臟，胰腺因含有較高濃度的內(nèi)源性過(guò)氧物酶在樣品濃度較高的情況下會(huì)和試劑盒底物反應(yīng)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

注意事項(xiàng):

若為皮膚組織，離心后，需去除上層脂肪，以及下層沉淀取中間層樣本用于檢測(cè)。

細(xì)胞樣本

1.細(xì)胞培養(yǎng)上清:

①使用 96，24，6孔板，(貼壁或懸浮)細(xì)胞密度達(dá)到60-90%。

②使用6-10mm培養(yǎng)皿，T25/T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，(貼壁或懸浮)細(xì)胞密度達(dá)到60-90%。

③懸浮細(xì)胞:2-8'℃，2500rpm離心5min，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

④貼壁細(xì)胞:直接收集上清液，2-8°℃，2500rpm離心5min，收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清。

⑤立即用于檢測(cè)，或分裝于-80'C凍存?zhèn)溆谩?/span>

2.細(xì)胞裂解液:

(1)懸浮細(xì)胞:

①2-8°℃，2500rpm離心5min，收集細(xì)胞。2加入預(yù)冷的PBS,輕輕混勻，2-8°℃，2500rpm離心5min，收集細(xì)胞。

③加入0.5-1ml中等強(qiáng)度RIPA細(xì)胞裂解液(注意RIPA裂解液PH值需為PH7.3，建議不要使用含NP-40，Triton X-100 和高濃度 DTT 的組分，會(huì)抑制抗原抗體反應(yīng)。若無(wú) RIPA 裂解液，可使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH 7.3)及適量蛋白酶抑制劑(如 PMSF，工作濃度1mmol/L),置于冰上，裂解 30min-lh。裂解過(guò)程中可用槍頭吹打或間斷搖動(dòng)離心管，使蛋白充分裂解,出現(xiàn)黏糊狀是 DNA，可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波3-5mm探頭，功率150-300W,冰上超聲處理樣品，工作1-2s，停止30秒，3~5個(gè)循環(huán)。)

④裂解或超聲破碎完成，2-8°℃，10000rpm 離心 10min上清移入 EP 管中，立即用于檢測(cè)，或分裝于-80°C凍存?zhèn)溆谩?/span>

(2)懸浮細(xì)胞:

①吸走上清液，加入預(yù)冷的 PBS 洗三次。

②加入0.5-1m[ RIPA 細(xì)胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(具體要求同懸浮細(xì)胞)，用細(xì)胞刮輕輕刮下貼壁細(xì)胞。

③細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，置于冰上，裂解 30min-1h，或者配合超聲波破碎(同懸浮細(xì)胞)。

④裂解或超聲破碎完成，2-8°℃，10000rpm 離心 10min上清移入 EP 管中，立即用于檢測(cè)，或分裝于-80°C凍存?zhèn)溆谩?/span>

注意事項(xiàng):

細(xì)胞裂解液，建議使用超聲波輔助破碎，超聲波可有效打斷DNA，DNA 成為片段后不容易干擾試劑盒工作。

細(xì)胞培養(yǎng)上清液/細(xì)胞裂解液的選擇:

根據(jù)目的物所在部位，可選擇細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本。

如果目的物是分泌型，(包括可分泌型的膜蛋白)，即可選擇細(xì)胞培養(yǎng)上清作為樣本;

如果目的物主要存在于胞內(nèi)，則建議選擇細(xì)胞裂解液作為樣本類(lèi)型，部分包內(nèi)蛋白也可能通過(guò)分泌或者細(xì)胞凋亡而泄露到培養(yǎng)基中而上清也可被檢測(cè)。

痰液樣本

①選擇痰液中較為粘稠部分稱(chēng)重，加兩倍于痰量的0.1%DTT(二硫蘇糖醇,主要作用是溶解粘液)，反復(fù)吹打，漩渦器振蕩 15s，37 度恒溫水浴振蕩5分鐘;

②加兩倍于痰量的PBS緩沖液,繼續(xù)振蕩15-20分鐘，150目的金屬絲網(wǎng)過(guò)濾，1500rpm離心10分鐘吸取上清液檢測(cè)。

唾液、尿液樣本

用無(wú)菌管收集樣品，2-8°C下以10,000xg離心2分鐘?；?000-3000rpm離心20分鐘，收集上清液，可立即檢測(cè)，或分裝凍存于-20°C或-80°℃。盡量減少凍融循環(huán)。